1. 原代細胞凍存復(fù)蘇技術(shù)簡介
在ELISPOT檢測的應(yīng)用中，往往需要用到凍存的淋巴細胞樣品作為檢測細胞。由于ELISPOT檢測的是細胞的免疫功能，不僅僅需要保持細胞的存活率，而且還要保證細胞的功能不發(fā)生變化。傳統(tǒng)的細胞凍存方法通常是為了保存細胞株，對細胞存活率的要求不高，更沒考慮保持細胞原有的免疫狀態(tài)，所以傳統(tǒng)的細胞凍存方法已經(jīng)不能滿足ELISPOT檢測的要求。參見圖7.1。
考慮到ELISPOT檢測的特殊性，荷蘭U-CyTech公司經(jīng)過精心的研究與反復(fù)的驗證，推出了Cryostar™凍存試劑盒，在凍存液中添加了一系列對細胞有特殊保護作用的保護劑。達科為公司在接到Cryostar™凍存試劑盒之后，在我們的實驗室以及國內(nèi)數(shù)家客戶的實驗室做了細胞凍存與復(fù)蘇的實驗，并且對復(fù)蘇之后的細胞做了ELISPOT檢測。結(jié)果表明，淋巴細胞的存活率超過90%，ELISPOT斑點形成頻率與新鮮細胞*相同。
2. 細胞凍存、復(fù)蘇的標準程序
l 實驗儀器：
    ² 可控溫度細胞離心機離心機；
    ² 血球計數(shù)板或者自動細胞計數(shù)設(shè)備； 
    ² 細胞程序降溫盒Nalgene “Mr. Frosty”；
    ² -70°C冰箱；
    ² 液氮罐；
    ² 37°C水浴鍋。
l 耗材準備
    ² 15ml圓錐底聚丙烯（PP）離心管； 
    ² 無菌的原代細胞凍存管，2ml，外螺旋；
l 試劑配制
    ² 熱失活補體胎牛血清； 
    ² R0培養(yǎng)基：RPMI-1640培養(yǎng)基，含谷氨酰胺，加入1%雙抗，不加血清。
    ² 達優(yōu)®無血清培養(yǎng)基：已經(jīng)含有谷氨酰胺和雙抗，打開即用。
    ² Cryostar™重懸液(Cryostar™ Resuspension Medium)：含有細胞凍存保護成分，-20°C長期保存，4°C可以保存6個月。
    ² Cryostar™ 2×凍存液（Cryostar™ Freezing Medium）：含有原代細胞凍存保護成分以及DMSO，-20°C長期保存，4°C可以保存6個月。